他们原计划把修道院院长的桌子将放在餐厅的另一端（那里也有其他壁画），这样桌子就能面对耶稣和使徒们，壁画下面是供修道士进入餐厅的通道。他们的长餐桌从餐厅的一端一直延伸到另一端，似乎在和画中人共同进餐。桌子的一边是耶稣，另一边是院长。
然而不幸的是，列昂纳多并没有把这当成一次单纯的壁画创作，而是试验了一些颇具风险的技术，在潮湿的石膏墙上使用了蛋彩颜料。他按照自己的喜好把颜料与蛋清、油或是清漆在干的灰泥墙上调合。这是一种非传统的混合方法，不能被墙吸收。因此，他的整幅壁画只有薄薄的一层和墙粘在一起，没过多久就因为潮气析出的盐分而片片剥落。就画本身而言，它可能是一幅杰作，但从壁画保存角度来说却是一场灾难，这是列昂纳多为数不多的失误。如最近艺术史学家利奥·斯坦伯格所言，“列昂纳多·达·芬奇的《最后的晚餐》是艺术史上最伟大的杰作，但从来就没有真正存在过”.
早在1540年，这幅作品就已经被形容为“只剩下一半了”.1560年的记录显示，它的大部分颜料已经消失。在斑驳的残留物中，未上颜料前的草图清楚地显露出来。1568年，历史学家保罗·罗纳佐曾写道：“这幅壁画已经完全毁了”.十年后，参观了修道院的乔尔乔·瓦萨里痛心地说：“除了一堆污点，这里什么都没有了”.在接下来的几个世纪里，情况越来越糟。共有19个画家企图复绘列昂纳多的杰作，厚厚的颜料和胶粘剂让原作完全不见天日。
1624年，这幅壁画几乎被视为无物。因此，修士们才会毫无顾虑地在墙上开了一个大大的门洞方便通行。此举不但砍掉了耶稣和两侧门徒的双脚，榔头的重击还震掉了更多颜料.
现在要保存这种上色不牢的早期壁画是很容易的事情。但在那个年代，如果壁画是在一面析水的墙上，人们就对此毫无办法，只能听任盐分让画和墙面分离。1726年，修道士们决定修复壁画，然而这个决定却他们敲响了这幅杰作的丧钟。他们找来了一个叫米开朗基罗·贝罗蒂的二流画家，此人称自己有一个秘方能让壁画重放光彩。在得到修道士同意后，他用床单和帆布把工作的地方遮挡起来，然后就消失在布帘后面，开始变魔术。时间一周周地流逝，没有人敢到布帘后面看一眼，因为他警告过千万不能偷看。
终于有一天，贝罗蒂拉开了布帘，向他们展示了一幅焕然一新的壁画。修道士们都大吃一惊，他们做梦都没有想到壁画的色彩会变得如此辉煌。欢欣鼓舞的修道士们付给贝罗蒂一大笔钱作为报酬。实际上，他只不过是在列昂纳多的壁画上画了一幅自己的画。
没过多久，贝罗蒂粗糙的颜料就因为窗外透进的阳光而褪色，壁画开始疯狂地脱落。后来有不少人试图将脱落的画粘回去，但收效甚微。1770年，修道士们决定进行另一次大修复。朱塞佩·玛扎竟然带着一幅扑克牌来了！他的办法是用扑克牌把表面将要脱落的颜料和泥灰全部刮掉，然后将墙上坑洼不平的洞补上，再涂上新颜料，只要远处看是一幅完整的画就行了。
1796年，拿破仑·波拿巴的大军到达此处。在看到这间大餐厅后，他们认为拿来当粮草弹药库简直再合适不过了。法国传记和游记作家亨利·司汤达曾在书中写道：骑兵们取乐的方法竟然是向壁画掷砖头，谁能打中使徒们的脑袋谁就赢了.这幅壁画遭受的苦难至此还远未结束！
1800年，这幅壁画下的大门终于被封上了，这也是我们现在看到的模样。但是没过多久，房子就被水淹了，整个餐厅浸泡在水里，使壁画更加松动。1807年，圣玛利亚感恩修道院被征用为兵营，人们这时才对餐厅通风、清洁并且重新粉刷。《最后的晚餐》的情况虽然没有好转，但至少终于有人精心保护它了。1821年，斯蒂芬诺·贝拉兹计划将整幅壁画从墙上挪下来以便保护，但他很快就放弃了，因为在刚开始处理时就毁掉了一大块桌布。
壁画家路易吉·卡维纳奇于1906到1908年对它进行了大范围修复。但由于壁画颜料本身的特点，他只修复了损毁的部分，让脱落和复绘的地方保持了原状。在他之后，修复师奥雷斯特·西尔维斯特里于1924年用淡黑色灰泥将画的边沿封住。1943年8月15日，战争的炮火几乎将餐厅毁灭。幸运的是，由于之前北面的墙已经用沙袋保护起来，所以《最后的晚餐》还是完好无缺。但是随着战事的继续，沙袋中的沙子变得潮湿起来。在一年多的时间里，这幅壁画所处的环境极其恶劣。
后来重建餐厅的时候，马罗·佩里西奥里将壁画彻底清洁了一番，将上面的霉变去除，在所有可能的地方用虫胶固定。这项工作一直持续到1954年，他固定了整幅壁画，画面的颜色也恢复了以前的光彩，但他并没有把后来复绘的部分去掉。摄影师将修复完的《最后的晚餐》拍了下来，这就是我们在20世纪后期看到的和《蒙娜丽莎》一样广为人知的经典杰作。然而很少有人知道，照片上的所有部分几乎都不是出自列昂纳多·达·芬奇之手。从瓦萨里在1560年写下“一堆污点”时，列昂纳多的原作就几乎不复存在。在目前满是粘合剂和复绘的作品之下，只有不到1/5是原作，而这1/5仍在继续消失。
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