周、齐、湘、代、岷诸王，多不自安，互相勾结。接着建文帝利用或有或无的罪名先对那些较小较弱的藩王采取行动。湘王朱柏自焚死，齐王朱_、代王朱桂、岷王朱F有罪，都被废为庶人。燕王便成了下一个目标，但朝廷在行动上很小心谨慎，不急于动手，可是，这样一来反而给了燕王做准备的机会。燕王已经用招降蒙古士兵的办法扩充了他的部队，同时他又与一些朝廷的宦官内外勾结起来。
１３９９年８月，燕王朱棣誓师抗命，下谕将士，打着“清君侧”旗号起兵“靖难”。史称“靖难之役”。朝廷和燕王之间开始了一场血腥的、持续三年的军事对峙。在叛乱开始的时期，燕王尚不占兵力上的优势。他的军队只有十万人；除了他的封地北京之外他也没有能够控制任何其他领土。南京的建文朝廷有一支三倍于燕王军队的常备军，拥有全国的经济，并且已经废除了几个藩国。但燕王的领导能力、高素质的军队却非建文帝可比。随着战争时间的延长，朝廷指挥不当、兵力孱弱、内部松懈的缺点严重影响了战局。直至节节败退，许多将领投降了燕王。
建文朝廷曾从朝鲜输入许多战马，想以此增强它的战斗力，因为朝鲜国王李芳远公开表示支持建文帝打燕王。但是这些办法未能影响一败涂地的战争结局。
建文四年六月，燕军渡江直逼南京城下，谷王朱*与曹国公李景隆开金川门迎降，京师遂破。燕兵进京，在燕王军队抵达后的一场混战中，南京城内的皇宫大院起了火。当火势扑灭后在灰烬中发现了几具烧焦了的残骸，已经不能辨认，据太监说它们是皇帝、皇后和他的长子朱文奎的尸体。朱棣登位后，将忠于建文的诸臣剥皮的剥皮，下油锅的下油锅，把他们的女眷罚到教坊司当官妓，实行残酷的“转营”，即轮流送到军营中去，一个女子每一日一夜要受二十余男子的凌辱，情况还要经常报告朱棣，有被摧残至死的，朱棣就下圣谕将尸体喂狗吃了。
但建文帝的下落终成为一件悬案。谁也不能肯定他是否真的被烧死了；后来对他的帝业抱同情心的历史学家们都说他乔装成和尚逃离南京。当时官方的记载当然只能说皇帝及其长子已死于难中；否则，燕王就不可能名正言顺地称帝了。建文帝最后的真正命运仍然是一个谜。
据《明史》的记载：“谷王*及李景隆叛，纳燕兵，都城陷。宫中火起，帝不知所终。燕王遣中使出帝后尸于火中，越八日壬申葬之。或云帝由地道出亡。正统五年，有僧自云南至广西，诡称建文皇帝。知府岑瑛闻于朝。按问，乃钧州人杨行祥，年已九十余，下狱，阅四月死。同谋僧十二人，皆戍辽东。自后滇、黔、巴、蜀间，相传有帝为僧时往来迹。”有一个九十岁的老和尚利用这个传说来到了正统皇帝的朝廷，自称他是从前的皇帝。这个骗子后来被揭露并处死了，但这个事件却助长了人们的幻想，也激发了其他相关传说的产生。
有学者认为，“靖难之役”后建文帝逃亡到了青海瞿昙寺。《创新渭源县志》载：“建文于夏六月庚申十三日未时，由癸门出，比时愿扈驾车二十二人，节其一也。君臣奔窜崎岖，昼伏夜行。历滇南、巴蜀，建文至乐都瞿昙寺……”永乐以来，明朝历代帝王给瞿昙寺赐匾、修佛堂、封国师、赐印、派大臣等史不绝书，这种割舍不断的关系本身就耐人寻味。南朝时期，已开通从南京历巴蜀、河湟至于阗的所谓“丝绸南道”，“靖难之役”后，北方道路被燕军所封，建文帝只有向南方逃窜，辗转云贵、巴蜀，最后选择西北边荒的河湟地区作为落脚点，是极有可能的。
《明史纪事本末》说，建文帝流浪三十九年，于英宗正统二年被认出，朝廷也不知他是真是假，有老太监吴亮，过去曾经侍奉过文帝，使他来辨认，朱允梢患太监即呼道：“你是吴亮？”答道：“我不是！”允捎值溃何夜去在御便殿，曾有一次，我有一片肉弃地，你伏在地上，舌食之，你难道忘记此事？”老太监大哭。入居宫中，寿年而终。《长安西话》说，葬于西山。北京龙潭现存有一丘一碑，碑上刻着“天下大师墓”，相传即为建文帝之墓。
在《明史-姚广孝传》和《胡滢传》里记载：对建文帝是否自焚而死，永乐帝不放心，有人告诉他建文帝削发为僧外逃了。他把建文帝的主录僧溥洽抓了起来关进监狱长达十余年，逼他供出建文帝下落。并派亲信胡滢与认识建文帝的内侍朱祥，以寻访道士张三丰为名，从陆路遍访各州、郡、乡、邑，去查访建文帝下落，长达十六年之久。永乐二年又有谣传建文帝逃亡海外，永乐帝又派郑和七下西洋，也未查到建文帝下落。《明史-郑和传》说：“成祖疑惠帝亡海外，欲踪迹之。”一直到朱棣死前一年的一个晚上，他已睡下了，但听说胡滢回来了，急忙穿上衣服，在卧室单独召见。也有记载说，胡滢访得建文帝离开紫禁宫后，削发为僧，既没有去神乐观，也没有去西南、东南周游避难，而是被僧司溥洽所救，一直藏在江苏吴县普洛寺内，此后一心为僧，无复国之意。
也有学者说，建文帝自焚身亡是历史真实，因为当时燕军兵临南京城下，建文帝想逃也来不及了，更何况经实地考查南京也无鬼门、御沟逃路。建文帝深知燕王朱棣志在夺位，也绝不会让他活下去。朱棣为了不留下“杀侄夺位”之臭名，故意苦心寻找建文帝下落，留下了历史疑案，这可能是朱棣的用心之机。
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